C-Caspas3免疫組化
免疫熒光固定(防止離體組織自溶抗原擴散),疫組固定液包括:有機溶劑(甲醇、疫組乙醇等);交聯劑(4%PFA、疫組10%中性福爾馬林),疫組固定液的疫組選擇取決于被研究抗原的性質及所用抗體的特性,不過,疫組目前甲醛用的疫組還是較多的,但針對磷酸化的疫組抗體,不适合用甲醛,疫組會導緻磷酸蛋白從膜表面轉移到胞漿中,疫組故應選擇冰冷的疫組無水甲醇或無水乙醇,同時應注意甲醛會揮發,疫組在4-8°C不宜儲存太久。疫組固定時間:取決于組合塊的疫組大小和類型,對于大多數組織,疫組18-24h較為理想,細胞固定時間較短,一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細胞樣品為例:用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次3min。免疫熒光技術中,以熒光物質标記抗體來定位抗原物質的方法被稱為熒光抗體技術。C-Caspas3免疫組化
免疫熒光的制作:樣品準備(貼壁細胞、懸浮細胞以及組織等):對于貼壁細胞:先将潔淨的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理,然後用幹淨無菌的鑷子放置到培養皿中,用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層後取出蓋玻片,操作小心,防止細胞脫片。對于懸浮細胞:有2種方法,①先在懸浮液中進行固定步驟,然後把細胞滴加在載玻片上,幹燥後細胞會緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟,離心洗脫,然後用移液管移至盒式玻片進行後續染色步驟。對于冷凍切片:切片放置在載玻片上後,可以直接進行固定等後續操作。對于石蠟切片:免疫熒光中石蠟切片較少,要先進行脫蠟和抗原修複處理。P62免疫熒光抗體法是利用熒光标記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法。
注意:從加熒光二抗起,後面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI複染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩幹後在圈内滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。玻片稍甩幹後用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(DAPI紫外激發波長330-380nm,發射波長420nm,發藍光;FITC激發波長465-495nm,發射波長515-555nm,發綠光;CY3激發波長510-560,發射波長590nm,發紅光)。兩種抗體同時孵育:由于FIT容易萃滅,因此在孵育抗體時後孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。
細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞内信号轉導,細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光标記技術相結合,原理就是利用抗原-抗體反應之後,采用熒光标記,标記完成後,顯微鏡下觀察細胞内某種抗原成分的多少,從而做出一個定位研究,也可以為細胞内信号傳導提供一個明确的指導,細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點,是目前比較常用的組織學技術,也是比較精确的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結合,其次是帶有熒光基團的二抗識别并結合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和内分泌系統的功能。
免疫熒光注意事項:對照實驗的設置:1、内源性組織背景對照:某些細胞和組織可能有固有的生物學性質,會産生背景熒光,對結果産生影響,例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前,應對樣品進行觀察,确保抗原本身沒有信号。2、陽性對照:用确認含有待測抗原的組織或細胞,與待測标本進行統一處理,結果應為陽性,可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照:與陽性對照相反,用明确不含有待測抗原的細胞或組織切片染色,結果若為陰性,可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果。在實際工作中,熒光抗原技術應用較少,因此通常将其稱為熒光抗體技術或免疫熒光技術。P62免疫
免疫熒光技術可以用于研究細胞内蛋白質的定位和表達水平。C-Caspas3免疫組化
免疫熒光法是将免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光标記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞内分布的方法。由于熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下檢出,從而可對抗原進行細胞定位。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織内抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術。免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理,先将已知的抗原或抗體标記上熒光素制成熒光标記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織内的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體複合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察标本,熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細胞或組織,從而确定抗原或抗體的性質、定位。C-Caspas3免疫組化
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